Влияние лазерного воздействия на биологические свойства винил-фосфонатов

Химические науки

1.4.9

Введение

Фотофармакология является быстро развивающейся областью современной науки, основанной на контроле биологической активности соединений благодаря световому эффекту [1]. Основным преимуществом подхода является возможность тонкой настройки биологической активности путем управления параметрами оптического излучения – спектральными и энергетическими характеристиками, длительностью воздействия, пространственной локализацией.

Кроме того, свет можно рассматривать как неинвазивный инструмент контроля биологических процессов. Все это открывает путь к созданию «умных лекарств» с возможностью удаленного и точного контроля мест и длительности их терапевтического эффекта. Внедрение «умных лекарств» в медицинскую практику позволит решить проблему неконтролируемой лекарственной активности во времени и пространстве, которая приводит к побочным эффектам на здоровые органы, а также к накоплению биологически активных веществ в окружающей среде и тяжелому природному загрязнению.

Фотоуправляемые соединения можно разделить на две группы: растворимые фотохромные лиганды и прикрепляющиеся фотохромные лиганды. Растворимые фотохромные лиганды не требуют дополнительной модификации молекул-мишеней, на которые направлено их действие. Прикрепляющиеся фотохромные лиганды позволяют контролировать активность молекул-мишеней с очень высокой избирательностью, благодаря необратимому образованию ковалентных связей [2].

Под действием излучения в фотофармакологии активируется и дезактивируется биологическая активность соединений, обладающих лекарственными свойствами в отношении мишени. Мишень в свою очередь должна быть восприимчива к изменениям, вызванным светом в структуре фотофармацевтического агента – фотоуправляемого соединения. Кроме того, мишень должна быть локализованным заболеванием и должна находиться в месте, доступном для воздействия света [3].

Среди «фотопереключаемых» соединений отдельно стоят производные на основе фосфонатов [4-6]. Чаще всего фосфонатные производные применяются при исследовании ингибирования холинэстераз. Область применения фосфорорганических соединений антихолинэстеразного действия в первую очередь относится к лечению нейродегенеративных расстройств, где ингибиторы АХЭ широко назначаются в клинической практике для лечения болезни Альцгеймера, что является новым направлением в фармакологии [7]. Также антихолинэстеразные вещества применяются при лечение кожных заболеваний [8]. Весслер и др. связали повышенные уровни ацетилхолина в биоптатах толщиной 2 мм у пациентов с атопическим дерматитом. Исследование также показало, что введение большего количества ацетилхолина в кожу вызывает ощущение зуда, похожее на зуд при атопическом дерматите. Было показано, что уровень ацетилхолина в тканях больных атопическим дерматитом в 14 раз выше в поверхностных биоптатах кожи, чем у контрольной группы, что делает его надежным биомаркером заболевания [9]. Экспрессия альфа -7-никотинового рецептора в коже, представляющего собой тип никотинового ацетилхолинового рецептора, может привести к разработке новых методов лечения и профилактики фибросклеротических заболеваний кожи, вульгарного псориаза, атопического дерматита, акне, фотодерматозов и внешнего старения кожи [10].

Ранее нами уже были продемонстрированы группы соединений [11,12], обладающих фото-переключаемым ингибированием бутирилхолинэстеразы (БХЭ). Проведенные эксперименты, а также данные молекулярного моделирования соединений показало взаимодействие с ферментными центрами БХЭ для обоих изомерных состояний.

Основываясь на успешные результаты исследования предыдущих серий фосфонатов, а также для расширения возможностей их использования в фотофармакологии, мы синтезировали новый класс ингибиторов, демонстрирующих антихолинэстеразное действие, модулируемое при оптическом воздействии - диалкил (Z)-(2- хлор-2-фенилвинил)фосфонат. В этой работе мы представляем исследование по изменению биологической активности новых фосфонатов, с потенциальным применением в качестве ингибитора БХЭ, при облучении на длине волны 266 и 325 нм. Материалы и методы В качестве объекта исследования в данной работе выбран ряд соединений, относящихся к классу винил-фосфонатов. Подобные асимметрические структуры с двойной связью, как винил-фосфонаты, являются перспективными объектами для исследования их изомеризации под действием внешних факторов, например, лазерного облучения. Данное структурное изменение может приводить и к изменениям биологической активности серии, вследствие более удачного расположения заместителей, приводящих к образованию более сильного взаимодействия в паре «лиганд-белок».

Синтез исследуемых в работе соединений был осуществлен на базе реакции пентахлорида фосфора с непредельными соединениями, в частности – фенилацетиленом, показан на рисунке 1. Более подробно процедура синтеза, а также описание физико-химических свойств данных соединений представлены в публикации [13]. Полученная на первой стадии кислота была введена в реакцию с соответствующими спиртами с получением конечных продуктов - (1-3), представленных на рисунке 1. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ЯМР – спектроскопии на ядрах 31 Р. Рисунок 1. Структурная формула молекул фосфонатов (1-3) Существенным недостатком данной серии является их малая растворимость в воде, что впоследствии может сказаться на биологической и фармацевтической доступности лекарственного препарата. Исходя из данного факта, все исследования биологических и оптических свойств винил-фосфонатов (1-3) проводились в широком ряду органических растворителей, из которых был выбран наиболее подходящий для различных методов исследования.

Измерение биологической активности Измерение биологической активности новой серии винил-фосфонатов (1-3), предполагаемых ингибиторов холинэстеразы, проводилось с помощью биоаналитической платформы EasyCheck. Метод, положенный в основу монито- ринга нейротоксичных соединений, основан на определении активности фермента бутирилхолинэстеразы (БХЭ) по начальной скорости биокаталитического гидролиза его субстрата - бутирилтиохолина, которую измеряют по накоплению тиохолина с использованием тиол-чувствительного сенсора. Поскольку тиохолин электрохимически активное соединение, в работе использовался амперометрический способ его регистрации при заданном потенциале +600мВ [14, 15].

Лазерное облучение

Лазерное облучение растворов винил-фосфонатов проводили с использованием твердотельного лазера Coherent MBD 266 (Санта-Клара, Калифорния, США) (λex = 266 нм, мощность 70 мВт, λex = 325 нм, мощность 30 мВт) несфокусированным лазерным лучом (d = 2 мм) в кварцевой кювете, толщиной 1 см при постоянном перемешивании.

Измерение спектров поглощения проводились при нормальных условиях на длине волны в диапазоне 200-700 нм в кварцевых 1 мм кюветах на прецизионном двухлучевом сканирующем спектрофотометре Lambda 1050 (Perkin Elmer). Облучение происходило в течение 60 мин, после чего происходило измерение спектров поглощения и биологической активности веществ. Для изучения воздействия лазерного излучения на биологическую активность винилфосфонатов (1-3) готовилось растворы исследуемых соединений с концентрацией 10 -3 - 10 -6 М. Для проверки/ учета влияния лазерного воздействия на выбранные растворители проводились также эксперименты по их засветке при описанных выше условиях.

Результаты и обсуждение

Биологическая активность.

Винил-фосфонаты (1-3) были исследованы на наличие биологической активности, для каждого была построена калибровочная зависимость и подсчитаны IC 50 - концентрации полумаксимального ингибирования. На рисунке 2 показаны калибровочные зависимости винил-фосфонатов (1-3) для различных концентраций в дихлорметане.

Рисунок 2. Калибровочные зависимости (процент ингибирования, концентрация) ингибирования БХЭ винил-фосфонатов (1-3) В ре… — см. PDF статьи.

Биологическая активность соединений 2 и 3 практически идентична, так как эти соединения являются изомерами, и можно предположить, что разветвленность алкильной цепи не влияет на присоединение молекулы ингибитора к активному центру фермента.

Изменение биологической активности после лазерного облучения.

На рисунке 3 представлены данные по изменению биологической активности винил-фосфонатов в результате действия лазерного облучения двух длин волн. Диаграмма показывает, что в ряду винил-фосфонатов (1-3) не все вещества одинаково меняют биологическую активность под действием лазерного облучения.

Рисунок 3. Динамика биологической активности ряда винил-фосфонатов (1-3) в результате лазерного воздействия После облуче… — см. PDF статьи.

Выводы

Было продемонстрировано фотоконтролируемое изменение биологической активности винил-фосфонатов – диалкил (Z)-(2-хлор-2-фенилвинил) фосфонатов в дихлорметане. Было установлено, что исследуемая группа фосфонатов обладает биологической активностью – способностью ингибировать бутирилхолинэстеразу.

Было обнаружено выраженное влияние лазерного излучения на биологические свойства растворов винил-фосфонатов в дихлорметане. Было показано, что воздействие на растворы винил-фосфонатов лазерами с длиной волны 266 нм и 325 нм, приводит к увеличению ингибирующих свойств данной группы соединений. При облучение лазером с λex = 266 нм наибольшее изменение в биологической активности демонстрирует соединение 3. При облучении растворов винил-фосфонатов лазером λex = 325 нм, наибольшее изменение демонстрирует соединение 1.

Разработка новых фотофармакологических агентов, обладающих фотоконтролируемой биоактивностью, является современным, быстро развивающимся направлением в науке и в медицине. Поиск новых объектов, используемых, в качестве фотоуправляемых соединений в терапии ряда заболеваний, является чрезвычайно важной задачей. Таким образом, исследованные в работе объекты – винил-фосфонаты являются перспективным материалом для современной фотофармакологии.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России № 122041100086-5.